1　免疫 1.1　動物 選用體重10～12g同性或雌雄性各半的健康NIH小白鼠。 將動物隨機分為三組，每組16只或20只（同性或雌雄性各半，為保證攻擊后有16只或20只小白鼠，可適當多免疫幾只小白鼠），同時飼養(yǎng)健康小白鼠55只，備做對照用。 1.2　免疫原稀釋 將百日咳原液用生理鹽水或pH7.3±0.1磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋至成品菌苗濃度的1/2，然后再稀釋7.5×、37.5×、187.5×，百日咳參考菌苗稀釋至每ml含8IU，然后再稀釋成每ml含1.0IU（0.125ml）、0.2IU（0.025ml）及0.04IU（0.005ml）。 1.3　免疫方法 將不同稀釋度的免疫原分別免疫小白鼠，每只小白鼠各腹腔注射0.5ml。 2　攻擊菌及攻擊菌液的制備 2.1　菌種 小白鼠腦內攻擊用58030（18323）菌株。 2.2　培養(yǎng)基 可用包-姜氏培養(yǎng)基（含羊血20%～30%）或其他適宜的培養(yǎng)基。 2.3　培養(yǎng)溫度及時間 放35～37℃培育，第一代不超過72小時，攻擊時菌種的培育時間為20～24小時。原代菌種放2～8℃可保存2周。 2.4攻擊菌液的制備 將培育20～24小時的菌苔經肉眼檢查為純菌后，刮入生理鹽水或pH7.3±0.1緩沖生理鹽水，用滅菌脫脂棉過濾，測定濃度，然后用pH7.0～7.2水解酷素、蛋白胨水或肉湯稀釋成每0.03ml含菌8萬，作為試驗組的攻擊菌液，然后再連續(xù)稀釋，使每0.03ml分別含8000、800、80及8個菌，以上5個不同稀釋度的菌液，作為對照組的攻擊菌液。 2.5　工作起止時間 自攻擊菌液制備（開始刮菌）至注射完最后1只小白鼠不得超過2.5小時。 2.6活菌計數 在攻擊前后，可將0.03ml含8個菌的攻擊菌液，接種于包一姜氏培養(yǎng)基或其他適宜的培養(yǎng)基平皿中，每個平皿0.2ml，每次不得少于2個平皿，其菌落形成單位約為濁度測定的1/4。 3　攻擊 動物免疫后14天，每只小白鼠腦內攻擊0.03ml菌液（含8萬個菌），用0.25ml注射器，4號針頭。在試驗組攻擊后再進行對照組毒力測定，對照組每稀釋度攻擊10只小白鼠。 4　記錄結果 動物攻擊后觀察14天。攻擊后第2天，將試驗組動物處理成每組16只或20只。以后逐日觀察動物并記錄死亡數，最初3天死亡的動物不作統(tǒng)計，至第14天有麻痹、頭部腫脹、弓背及明顯聳毛的動物按死亡計算。 5　結果計算 5.1　按Wilson-Worcester氏法計算參考菌苗及待檢菌苗的ED50±SD%，每個ED50標準差的范圍一般應為64%～156%。 5.2　按Reed-Muench氏法計算對照組LD50，1個LD50的菌數應不高于800個菌。 5.3　計算均質性因子“α”。 5.4IU計算 待檢原液每ml應含IU=參考菌苗ED50/待檢原液ED50×參考菌苗每ml的IU數 6　效力評價 百日咳原液按成品菌苗嘗試稀釋后，每個接種劑量的免疫效價應不少于4.0IU。